Recogida y preparación de muestras

Una vez finalizado el periodo de muestreo (una semana de forma habitual, o con mayor frecuencia en los periodos de máxima incidencia polínica), se inicia de nuevo el montaje del tambor en el laboratorio, traslado al lugar donde se encuentra ubicado el captador y sustitución del tambor. El tambor correspondiente al muestreo realizado con anterioridad se traslada al laboratorio en el porta-tambor en las mismas condiciones comentadas anteriormente. En el laboratorio se realizará el proceso de preparación de las muestras, tratando de evitar la contaminación del mismo.

Con respecto a la hora del día en la que se debe realizar el cambio de las muestras, se recomienda como norma general la de las 12.00 UTM. De esta forma, y como se verá a continuación, dado que a la hora de realizar el montaje se utilizan fragmentos de cinta correspondientes a 24 horas, cada muestra resultante comprende la fracción correspondiente a 12 horas de un día (de 12.00 horas UTM a 23.59 horas UTM), y 12 horas del día siguiente (de 00.00 horas UTM a 11.59 horas UTM).

2.5  Preparacion de muestras

En los laboratorios de las Unidades de Aerobiología de los Centros que conforman la REA, y sobre una mesa limpia preparada para este proceso, se dispone de los siguientes accesorios y elementos:

Pliego de papel secante. Con la función de proteger la superficie donde se va a realizar el montaje de las muestras, absorción del líquido que pueda derramarse y aumentar el contraste entre la preparación a montar y la superficie, más visible sobre fondo blanco.

Regla para el montaje. Viene incluida como accesorio en los modelos comerciales de los captadores actualmente disponibles. Dado que el aparato permite un desplazamiento de las muestras a razón de 2 mm la hora, se trata de una regla de metacrilato transparente, de más de 1 cm de grosor y con marcas establecidas a modo de hendiduras cada 48 mm. Esto facilita la división de la cinta de Melinex ® que se dispone sobre ella (el ancho de la regla es también superior al de la cinta) en fragmentos de 48 mm, correspondientes a 24 horas de muestreo continuado.

La cinta de Melinex se fija por ambos extremos a la regla, utilizando una porción de cinta adhesiva que nunca debe alcanzar la superficie impactada. En el caso del modelo comercial de Lanzoni s.r.l. la regla lleva incorporada una goma de succión la cual, una vez conectada al grifo de agua, permite la fijación de la cinta a la regla mediante vacío de aire. Las hendiduras en la regla facilitarán el proceso de corte de los fragmentos, a los que habrá que fijar por uno de sus extremos con una aguja enmangada y, con la ayuda de un cutter o cuchilla bien afilada, realizar un corte transversal a lo ancho de toda la cinta.

Figura 12: Cinta de Melinex sobre la regla de metacrilato en la que se diferencian los 7 días de la semana.

Portaobjetos para microscopio. Previo a realizar el corte de la cinta de Melinex® en fragmentos, se habrán dispuesto sobre el papel absorbente tantos portaobjetos como fragmentos de 48mm (correspondientes a 1 día) contenga el total de cinta impactada, hasta un máximo de 7 días.

Cada portaobjetos se identifica con una etiqueta adhesiva en la que habrá de anotarse el nombre o iniciales de la estación a la que pertenece y la fecha, siguiendo como norma, y dado que cada fracción de 48 mm suele contener datos correspondientes a 2 días naturales no completos, datar la muestra con la fecha correspondiente al primero de los días representados. De esta forma se genera una serie de muestras de días sucesivos y consecutivos.

El proceso de obtención de datos correspondiente a días naturales se detallará en el siguiente apartado. Los fragmentos generados tras la división de la cinta de Melinex se disponen sobre los portaobjetos, habiendo depositado sobre ellos previamente algunas gotas de agua que facilitarán la adherencia a la superficie. Es importante en este paso mantener tanto el orden sucesivo de fechas en el montaje como el principio y fin de la preparación.

Figura 13: Preparación correspondiente a un día completo con etiqueta de identificación.

Como norma, la muestra debe disponerse sobre el portaobjetos de tal manera que el inicio de la misma quede a la izquierda y el fin a la derecha. Para identificar ambas posiciones, la etiqueta de identificación se dispone a la izquierda. La lectura de las muestras al microscopio se realizará de izquierda a derecha, es decir, desde las horas correspondientes al día anterior hasta las horas correspondientes al día siguiente.

Montaje de las muestras diarias. La sustancia empleada en el montaje de las muestras debe reunir las siguientes características: 1. Ser soluble en agua; 2. Ser compatible con el adhesivo en uso; 3. Permitir la tinción selectiva del material que nos interesa analizar (opcional); 4. Permitir el almacenamiento de larga duración del material.
De forma tradicional, se ha venido utilizando glicerogelatina teñida con fucsina. Su composición, segn receta, incluye 50 ml de glicerina, 7 gr de gelatina, 1 gr de fenol y una pequeña cantidad de fucsina básica diluidos en 42 ml de agua destilada, mezclada con agitador eléctrico en campana de gases debido al carácter tóxico del fenol. La mezcla resultante es de color rosado. Este medio se ha elegido porque cumple las características mencionadas anteriormente y es compatible con la sustancia adhesiva de uso en la REA (fluido de silicona). Por otro lado, el uso de fucsina básica facilita una mejor identificación y recuento de los granos de polen, ya que esta tinción es específica para el material vegetal. Todos los productos químicos que intervienen en la composición de la glicerogelatina, así como los del fluido de silicona, deben estar almacenados en condiciones adecuadas en cumplimiento de la Normativa de Seguridad e Higiene en el Trabajo vigente.

La glicerogelatina es sólida a temperatura ambiente, siendo necesario licuarla para su utilización. Es preferible para ello utilizar un horno microondas por la rapidez con que se realiza el cambio de estado, apenas unos segundos.

Una vez licuada, y con la ayuda de un dispensador de gotas, se dispone una línea continua sobre el cubreobjetos, que se colocará posteriormente sobre la muestra y el portaobjetos. Es recomendable que la línea sea continua y que no queden burbujas de aire al depositarla, ya que esto haría más dificultosa la identificación y análisis. Si quedaran algunas gotas de aire dispersas sobre la superficie, con ayuda de un objeto no punzante debe presionarse ligeramente para que éstas puedan desplazarse hacia los bordes antes de que la glicerogelatina se solidifique de nuevo.

Foto 14: Disposición de glicerogelatina sobre el portaobjetos.

Medio de sellado. Se recomienda el sellado de las muestras por el borde del cubreobjeto con una sustancia que permanezca inalterable a lo largo del tiempo. Para ello se utiliza laca-esmalte transparente, que re ne, entre otras cualidades ventajosas su bajo precio y fácil adquisición, fácil manejo, baja toxicidad, rapidez de secado y gran periodo de inalterabilidad. Además, al ser de color transparente, no dificulta la identificación de la muestra. Las muestras selladas, y tras ser sometidas a un análisis microscópico (se detallará en el siguiente apartado), pueden almacenarse en contenedores específicos para muestras de microscopía óptica denominados comercialmente combi-box.

Figura 15: Sellado de muestra obtenida. A su lado, colección de muestras diarias.

Una vez montadas las muestras, es prudencial esperar un cierto tiempo antes de proceder a su lectura al microscopio. De esta manera, la glicerogelatina se solidificará actuando como adhesivo entre la cinta y el cubreobjetos. Este tiempo también favorecerá el que los distintos tipos polínicos se coloreen, siendo más evidentes sus características morfológicas externas.