El objetivo de la práctica es determinar cuantitativamente el impacto de varios productos sobre el proceso de división celular en plantas. Para ello, hemos utilizado cebollitas de la variedad denominada "francesa" en cultivo hidropónico. Tras varios dias de cultivo en agua destilada y a 25 °C, las raíces brotan a partir de la base del bulbo, y al alcanzar unos 5 cm de longitud, el medio (agua destilada) es sustituído por las siguientes soluciones:

Colchicina al 0,05%, cuyo tratamiento duró 4 horas.

Cafeína al 0,1 %, 4 h de tratamiento.

Hidroxiurea 0,75 mM, en tratamiento de 16 h.

Hidroxiurea + cafeína (0,75 mM y 0.1%, respectivamente) con la misma duración que el anterior.

Todos los tratamientos se realizaron a la temperatura mencionada, y dos bulbos permanecieron en agua destilada como control.

Tras los tratamientos, las raíces fueron fijadas y teñidas mediante la técnica de Feulgen, específica para el DNA, que permite una clara visualización de núcleos y cromosomas. Una vez realizadas las tinciones, las preparaciones se montan para su apropiada conservación. Estas preparaciones sólo contienen, en principio, el meristemo de la raíz aunque es posible encontrar algunas de la cofia y epidermis.

En las distintas preparaciones, se tendrá que determinar el Indice Mitótico y, en su caso, porcentaje de mitosis y/o interfases anómalas. En cada caso se tendrá que tener en cuenta:

Control.- Es imprescindible una correcta determinación del índice mitótico, ya que estas preparaciones serán el punto de referencia para las comparaciones posteriores. Por tanto, será necesario distinguir correctamente las mitosis (profase, metafase, anafase y telofase) de las interfases. Además, es aconsejable familiarizarse con la morfología "normal" que presenta cada estadío de la división celular. Las células no meristemáticas no serán tenidas en cuenta en el conteo de la preparación.

Colchicina.- Poderoso inhibidor de la polimerización de microtúbulos. Presenta un efecto especialmente visible durante metafase, ya que no permite el progreso de ésta hacia anafase, por lo que las células se detendrán en este estadío. Por tanto, será necesario determinar el índice mitótico, detectar mitosis morfológicamente anormales y cuantificar su presencia.

Cafeína.- En células vegetales inhibe la fusión de vesículas que dará lugar a la nueva pared celular durante telofase. Por tanto, el tratamiento con este agente produce células binucleadas. En estas preparaciones será necesario determinar que porcentaje de células interfásicas son binucleadas. Adicionalmente, se determinará el índice mitótico para comprobar otros posibles efectos de la cafeína sobre la división celular.

Hidroxiurea.- Droga muy efectiva como inhibidor de la fase S del ciclo (fase en la que ocurre la replicación del DNA). Tratamientos como el descrito arriba produce inhibición del ciclo no permitiendo a las células progresar a lo largo de dicha fase. Dado que el tratamiento es de más duración que el propio ciclo (que en estas células y a 25 °C es de 15 h , aproximadamete), cabe esperar un acumulación de las mismas en la fase S con el consiguiente descenso en el numero de mitosos. Por tanto, se determinará el indice mitótico y se tratará de observar la presencia de células de morfología anormal.

Hidroxiurea + cafeína.- El efecto combinado es conocido en células animales, donde la cafeína impide parcialmente que la hidroxiurea inhiba la replicación. No obstante, es frecuente encontrar formas anómalas de mitosis. El efecto de ambas drogas ha sido poco estudiado en plantas, aunque cabe esperar un alto número de células binucleadas, pocas mitosis y, posiblemente, figuras celulares de morfología alterada. En esta preparación, pues, se determinará el índice mitótico, el de células binucleadas, y se describiran con detalle las alteraciones más patentes.

Algunas fotos tomadas de las preparaciones:

La memoria deberá contener, al menos, los siguientes resultados:

Control: Indice mitótico e índices de fase (I.Fs.)

Colchicina: I.Fs. y descripción de las anomalías más frecuentes (si las hubiere).

Cafeína: descripción de las anomalías más frecuentes (si las hubiere).

Hidroxiurea: descripción de las anomalías más frecuentes (si las hubiere).

Hidroxiurea + cafeína: descripción de las anomalías más frecuentes (si las hubiere). Posible efecto de la aplicación de ambas drogas conjuntamente.

Finalmente, se incluirá un apartado de "conclusiones". Cualquier comentario sobre el desarrollo o contenido de la práctica podrá ser incluido (y será bien recibido) en este mismo apartado.

Algunos consejos para elaborar la memoria de la práctica II

1.- Hacer una breve introducción que incluya los objetivos de la práctica.

2.- Hacer un resumen muy escueto del desarrollo técnico de la misma (no hace falta incluir el protocolo).

3.- Exponer de forma clara los resultados referentes a pesos frescos, volúmenes, etc.

4.- Indicar las actividades obtenidas en el espectrofotómetro. Incluir, si se dispone de ello, las tendencias de las actividades obtenidas para cada material.

5.- Incluir una tabla con los resultados de la actividad total  y específica de cada enzima.

6.- Conclusiones.- En este apartado se incluirá cualquier explicación o interpretación de los resultados que puedan explicar los mismo. Hay que intentar explicar los datos en base al papel del ácido ascórbico en la protección antioxidante o en la regulación de la elongación.

 Consejos para el cálculo de actividades en la práctica segunda.

 Hay que calcular Actividad Específica (A.E.; en nmol min^-1 mg^-1 proteína), y Actividad Total (A.T.; en nmol min^-1 gramo^-1 peso fresco).

Ejemplo.- Hemos obtenido un total de 3,2 ml de fracción soluble (FS) a partir de 3,4 gramos de raíz. Se ha determinado por la técnica de Bradford que el contenido en proteína es de 14,7 mg por 5 ml de FS. Finalmente, hemos ensayado una actividad enzimática en el espectrofotómetro que dio como resultado 37,8 nmol min^-1 de sustrato metabolizado (oxidación de ascorbato, generación de guaiacol oxidado, etc.). Dicho resultado se obtuvo con 20 ml de FS en la cubeta de ensayo.

 Cálculo de A.E.:

Si el ensayo lo hemos realizado con 20 ml de FS y cada 5 ml de la misma contiene 14,7 mg de proteína (Bradford), es lógico suponer que los 20 ml contenía un total de 58,8 mg de proteína. Por tanto, si con esa cantidad de proteína hemos conseguido una actividad de 37,8 nmol min^-1, cabe suponer que con un 1000 mg (1 mg) de proteína obtendriamos:

                  1.000 x 37.8/58.8 = 642,85 nmol min^-1 mg^-1 proteína

                     O sea, A.E. = 642,85 nmol min^-1 mg^-1 proteína.

 Cálculo de A.T.:

 Si con 20 ml de FS obtuvimos una actividad de 37,8 nmol min^-1, cabe suponer que con TODA la fracción soluble habríamos obtenido:

                 37,8 x 3.200/20 = 6.048 nmol min^-1 (NOTA: 3,2 ml son 3.200 ml).

 Ahora bien, dicha actividad ha sido obtenida con toda la fracción soluble que, a su vez, provenía de haber procesado 3,4 gramos de raíz. Por tanto, la actividad total expresada en “gramo” de peso fresco (PF), será de

                 6.048 nmol min^-1/3,4 gramos = 1.778, 82

                 Por tanto, A.T. = 1.778, 82 nmol min^-1 g^-1 PF.

 Se puede encontrar una información extensa sobre las especies reactivas de oxígeno, el ácido ascórbico y su importancia en la protección antioxidante y en la regulación del crecimiento en plantas, en el trabajo que se encuentra pulsando el icono.